Introducción
Escherichia coli uropatógena (ECUP) es el microorganismo predominante en las infecciones del tracto urinario (ITUs). Se encuentra involucrada en el 75 % de las variantes no complicadas y el 65 % de las complicadas [1]. En Latinoamérica, ECUP es el principal microorganismo causante de ITUs, presentando elevados niveles de resistencia microbiana [2]. En Cuba, diversos estudios de susceptibilidad de ECUP a antimicrobianos, tanto en hospitales como en comunidades de distintas provincias, han reportado altos niveles de resistencia a los antimicrobianos comúnmente empleados para tratar ITUs [3,4]. Además, a nivel hospitalario, se ha identificado la presencia de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) [5].
La adhesión de ECUP a receptores de la mucosa, mediada por fimbrias como las tipo P, es clave para su patogenicidad y está codificada en "islas de patogenicidad" junto con otros FVs y mecanismos de resistencia. Interferir en este proceso representa una estrategia terapéutica relevante [1,9–15]. En los últimos años, la evaluación de compuestos vegetales ha emergido como una alternativa para inhibir FVs bacterianos [16–19]. Silva et al. [20] identificaron 371 fitoquímicos con esta actividad, abriendo nuevas perspectivas para la investigación etnofarmacológica, que busca validar el uso tradicional de plantas medicinales en ITUs [9,21– 23].
Existen referencias sobre la actividad de extractos y compuestos de plantas medicinales de diferentes regiones del mundo en la inhibición de diversos FVs, incluida la adhesión fimbrial de ECUP [9,10,16,20]. En Estados Unidos, se comercializan suplementos dietéticos a base del fruto de Vaccinium macrocarpon (Ericaceae), conocido co-mo arándano americano o cranberry, para el tratamiento y prevención de ITUs. Desde la década de 1980, diversos estudios in vitro, ex vivo e in vivo han demostrado su efecto sobre la adhesión fimbrial de E. coli P+ [22]. Además, metaanálisis de investigaciones clínicas sitúan a este producto de origen vegetal como líder frente a los FVs en las ITUs [24,25].
Es probable que las plantas utilizadas popularmente para tratar afecciones del sistema urinario, aunque no posean una actividad antimicrobiana destacada, basen su efectividad en la interferencia de FVs clave, como las fimbrias. También podrían actuar en sinergia con otros efectos, como diurético, modulador de resistencia microbiana, bacteriostático o bactericida moderado [22]. El objetivo de este trabajo es evaluar in vitro el efecto de extractos de plantas que crecen en Cuba, referidas tradicionalmente en las afecciones del tracto urinario, sobre la adhesión fimbrial de E. coli uropatógena y su sensibilidad al ciprofloxacino.
Metodología
Diseño y área de estudio
Se realizó un estudio experimental in vitro en el Departamento de Ciencia y Tecnología de los Alimentos de la Facultad de Ciencias Aplicadas de la Universidad de Camagüey, Cuba, y en el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, también en Camagüey. Las especies seleccionadas fueron identificadas y colectadas en localidades cubanas con antecedentes de uso tradicional en afecciones del tracto urinario.
Población y muestra
La población consistió en cepas bacterianas de ECUP. Se seleccionaron dos cepas: la de referencia ATCC 70033 (J96) y un aislado clínico (185) obtenido de una paciente con ITUs, esta última con perfil de resistencia tipo wild type. Ambas cepas fueron cultivadas y preparadas bajo condiciones controladas para su uso en los bioensayos.
Variables e instrumentos
Las variables evaluadas fueron la capacidad de los extractos vegetales para inhibir la adhesión fimbrial bacteriana y su efecto sobre la sensibilidad al ciprofloxacino. Los grupos experimentales incluyeron tres tipos de extractos vegetales (etanólico al 20 %, etanólico al 90 % y decocción) obtenidos de quince especies de plantas. Para evaluar la adhesión fimbrial, se utilizó el ensayo de hemoaglutinación con eritrocitos humanos A+, exponiendo las dos cepas de ECUP a las diferentes concentraciones de los extractos. La sensibilidad bacteriana al ciprofloxacino se determinó mediante el método de difusión en agar, utilizando discos impregnados con 5 µg del antibiótico. Los grupos de control incluyeron suspensiones bacterianas sin exposición a los extractos para evaluar la adhesión fimbrial, y medios de cultivo con discos de ciprofloxacino sin extractos para el análisis de resistencia bacteriana.
Procedimientos
Material vegetal
La selección de las plantas evaluadas se realizó principalmente por el criterio etnobotánico de su empleo para el tratamiento de afecciones del sistema urinario, o especies afines de géneros reportados con esta actividad. En la Tabla 1 se resumen las particularidades taxonómicas, nombre común y la parte empleada de las 15 plantas estudiadas; en el caso de V. ramonii se estudiaron las hojas y las ramas.
Todas las especies se colectaron en el Municipio Camagüey, Camagüey, excepto: R. mangle (Santa Cruz del Sur, Camagüey) y V. ramonii (Moncada, Viñales, Pinar del Río). La identificación botánica se realizó en el Herbario "Julián Acuña Galé" de la Universidad de Camagüey (HISP), donde se depositaron especímenes de muestra. El material vegetal se secó a la sombra, y posteriormente se redujo manualmente el tamaño de partícula de la droga.
Para obtener los extractos etanólicos, primero fue humectada la droga seca con el solvente durante tres horas, se maceró por cinco días a partir de 20 g de droga en 100 ml en etanol de 20 y 90 grados alcohólicos. Se filtró con papel de filtro y el solvente se evaporó en horno con recirculación de aire a 40 Co. La misma cantidad de droga cruda se empleó para obtener una decocción, calentándose durante cinco minutos después de comenzar a ebullir y se completó hasta el volumen inicial con agua destilada, según Miranda y Cuellar [26].
Determ inación in vitro del efecto inh ibitorio en la adhes ión fimbr ial de los extractos
El efecto inhibitorio de los extractos se estableció de forma cualitativa mediante el ensayo de hemoaglutinación de las cepas de E. coli P+ en presencia de eritrocitos humanos A+, según la metodología para evaluar la adhesión fimbrial de cepas enterotoxigénicas E. coli, sugerida por Barreto et al. [27]. Para este estudio se utilizaron dos cepas de ECUP: la referente ATCC 70033 (J96) y un aislado salvaje (185) procedente de una paciente con ITU.
Para poner en contacto los cultivos bacterianos con las soluciones de los extractos vegetales a una concentración subletal de hasta 1/8 Vol/Vol, se realizaron dos subcultivos por 24 horas en tubos de cultivo con 3 ml de medio líquido con Caldo Nutriente (BIOCEN) y uno en medio sólido en placas de Petri con Agar Nutriente (BIOCEN) por 24 horas, a partir de este crecimiento se prepararon suspensiones bacterianas a una concentración de 0.,5 en la escala de McFarland para realizar el bioensayo.
Tabla 1. Identidad y parte de las plantas evaluadas.
| Especie | Familia | Nombre común | Parte empleada |
|---|---|---|---|
| Achyranthes aspera L. | Amaranthaceae | Rabo de Gato | Parte Aérea |
| Agdestis clematidea Moç. et Sessé | Phytolaccaceae | Flor de Peo | Raíz tuberosa |
| Caesalpinia bahamensis Lam. subsp. bahamensis | Caesalpinaceae | Brasilete | Corazón del Leño |
| Dendropemon confertiflorus (Krug & Urban in Urban) Leiva & Arias | Loranthaceae | Palo Caballero, Injerto | Hojas |
| Lepidium virginicum L. | Apiaceae | Mastuerzo | Sumidad Florida |
| Melia azederach L. | Meliaceae | Paraíso, Prusiana | Foliolos |
| Momordica charantia L. | Cucurbitaceae | Cundeamor | Sumidad Foliácea |
| Morinda roioc L. | Rubiaceae | Palo Garañón | Raíz |
| Moringa oleifera Lam. | Moringaceae | Paraíso Francés, Tilo Americano | Foliolos |
| Pilea microphylla Liebm. | Urticaceae | Frescura | Parte Aérea |
| aPiper aduncum subsp ossanum (C DC.) Saralegui (P. ossanum) | Piperaceae | Platanillo de Cuba | Hojas |
| Rizophora mangle L. | Rizophoraceae | Mangle Rojo | Corteza |
| Priva lappulacea Pers. | Verbenaceae | Rabo de gato | Sumidad Florida |
| Turnera ulmifolia L. | Turneraceae | Marilope, Tapón | Sumidad Florida |
| *Vaccinium ramonii Griseb. | Ericaceae | - | Hojas, Ramas |
* Especies endémicas.
El bioensayo se realizó en una microplaca para ELISA de fondos cóncavos, 25µl de cada suspensión bacteriana se puso en contacto con 25µl de una solución de eritrocitos humanos A+ al 5% y se observó la homogeneidad de la mezcla, si luego de cinco minutos no tuvo lugar la reacción de hemoaglutinación que caracteriza el acoplamiento fimbria-receptor, el extracto se consideró activo y por el contrario, si ocurrió la hemoaglutinación, fue inactivo. El experimento se realizó por triplicado.
Evaluación de la mo du lación de la res istencia bacteriana de los extractos
Se evaluó la influencia del extracto etanólico (90%) de las especies vegetales sobre la resistencia de las dos cepas de ECUP mencionadas al ciprofloxacino, una fluorquinolona usualmente empleada en Cuba para el tratamiento de las UTIs. Las bacterias luego de crecer 24 horas en Caldo Muller-Hinton (Oxoid) a concentraciones subletales de los extractos, se sembraron en Agar Muller-Hinton (Oxoid) y se determinó la inhibición del crecimiento bacteriano mediante el método de difusión en agar según el CLSI [28], para lo cual se emplearon discos estériles de ciprofloxacino (5 µg) (Oxoid). El experimento se realizó por triplicado.
Análisis estadístico
Los resultados se analizaron mediante estadística descriptiva para identificar patrones en la actividad de los extractos sobre la adhesión fimbrial y la sensibilidad bacteriana al ciprofloxacino, calculando porcentajes de actividad para cada tipo de extracto (etanólicos al 20 %, 90 % y decocciones) y cepa bacteriana (ECUP, cepas 185 y ATCC 70033). Los datos sobre inhibición de la adhesión fimbrial se resumieron en frecuencias absolutas y relativas, mientras que la sensibilidad al antibiótico se expresó en diámetros de inhibición (mm), comparando los efectos entre cepas y extractos. También se evaluaron similitudes y discrepancias en la actividad entre las cepas, describiendo las coincidencias en la actividad antiadherente y moduladora de resistencia según los extractos. Los resultados fueron interpretados en función de umbrales de significancia biológica, aunque no se realizó análisis inferencial.
Aspectos éticos
En la realización de esta investigación la colecta del material vegetal se realizó de forma responsable y respetuosa con el ambiente; así como el manejo de los especímenes microbiológicos. Se tuvo la aprobación de la institución en donde se realizó el estudio.
RESULTADOS
Determinación in vitro del efecto inhibitorio en la adhesión fimbrial de los extractos
En la Tabla 2 se exponen los resultados del efecto inhibitorio de los extractos de 16 muestras vegetales de las 15 especies investigadas, sobre la adhesión fimbrial a eritrocitos humanos A+. En 13 plantas se verificó la interferencia sobre la adhesión fimbrial en al menos uno de los extractos. En ocho especies se evidenció actividad en todos los extractos frente a las dos cepas bacterianas, en dos plantas no se verificó efecto de ningún extracto en las dos cepas, solo las decocciones de dos plantas no mostraron efecto en las dos cepas. Se apreció un comportamiento similar de la actividad entre las dos cepas bacterianas en todos los tipos de extractos vegetales, excepto en dos especies.
Tabla 2. Efecto de los extractos vegetales sobre la adhesión de E. coli P+ uropatógena a eritrocitos humanos A+.
| Adhesión fimbrial | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| Cepa de Escherichia coli | |||||
| 185 | ATCC 70033 | ||||
| Especie | D | 20 | 90 | D | 20 |
| Achyranthes aspera | - | - | - | - | - |
| Agdestis clematidea | - | + | - | - | - |
| Caesalpinia bahamensis subsp. Bahamensis | - | - | - | - | - |
| Dendropemon purpureus | - | - | - | - | - |
| Lepidium virginicum | - | - | - | - | - |
| Melia azederach | + | - | - | + | - |
| Momordica charantia | + | + | + | + | + |
| Morinda roioc | - | - | - | - | - |
| Moringa oleífera | - | - | - | - | - |
| Pilea microphylla | + | + | + | + | + |
| Piper aduncum subsp. ossanum | - | - | - | - | - |
| Rizophora mangle | - | - | - | - | - |
| Priva lappulacea | - | NE | + | NE | - |
| Turnera ulmifolia | + | - | - | + | - |
| Vaccinium ramonii (hojas) | - | NE | NE | - | NE |
| Vaccinium ramonii (ramas) | - | NE | NE | - | NE |
| Control | + | + | + | + | + |
D: Decocción. 20: Etanol 20%. 90: Etanol de 90%. N E: No evaluado. +: Adhesión fimbrial.-: No adhesión fimbrial (efecto deseado).
En la Tabla 3 se muestra el porcentaje de los extractos vegetales con actividad sobre la adhesión fimbrial según el tipo de extracto y la cepa de ECUP. Los valores de porcentaje total de actividad en los tres tipos de extractos para las dos cepas superan el 75%.
Tabla 3. Porcentaje del total de extractos vegetales con actividad sobre la adhesión fimbrial de E. coli P+ uropatógena a eritrocitos humanos A+.
| Cepa de Escherichia coli | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| 185 | ATCC 70033 | ||||
| D | 20 | 90 | D | 20 | |
| Porcentaje (%) de actividad de extractos sobre la adhesión fimbrial | 75 | 77 | 78 | 80 | 85 |
Evaluación de la modulación de la resistencia bacteriana de los extractos
En la Tabla 4 aparece el efecto sobre la resistencia microbiana del extracto etanólico 90% en las dos cepas de ECUP. En la cepa autóctona y en la cepa de referencia se detectó un incremento de la sensibilidad al
ciprofloxacino en nueve y seis muestras vegetales respectivamente. La actividad sobre la resistencia microbiana al antibiótico en la cepa de referencia y la autóctona coincidió con el efecto sobre la adhesión fimbrial bacteriana en seis y cuatro extractos de plantas, respectivamente (Tabla 4).
Tabla 4. Efecto del extracto etanólico (90 %) sobre la sensibilidad de ECUP al Ciprofloxacino.
| Sensibilidad* | |
|---|---|
| cepa de E. coli | |
| Especie (extracto etanólico 90 %) | 185 |
| Achyranthes aspera | 23 |
| Agdestis clematidea | 29 |
| Caesalpinia bahamensis subsp. Bahamensis | 24 |
| Dendropemon purpureus | 18 |
| Lepidium virginicum | 20 |
| Melia azederach | 23 |
| Momordica charantia | 21 |
| Morinda roioc | 26 |
| Moringa oleífera | 24 |
| Pilea microphylla | 28 |
| Piper aduncum subsp. ossanum | 28 |
| Rizophora mangle | 25 |
| Priva lappulacea | 23 |
| Turnera ulmifolia | 18 |
| Vaccinium ramonii (hojas) | 27 |
| Vaccinium ramonii (ramas) | 24 |
| Ciprofloxacino | 22 |
* Diámetro de inhibición en mm
DISCUSIÓN
Resulta notable el número elevado de especies y de extractos vegetales que inhibieron en ambas cepas de ECUP evaluadas la adhesión fimbrial a los eritrocitos humanos A+, esto pudiera estar determinado porque las plantas fueron seleccionadas principalmente porque tenían referencia de empleo tradicional en el tratamiento de las ITUs. Silva et al. [20], refiere metabolitos usuales en el Reino Vegetal como ácidos fenólicos, cumarinas y flavonoides, con efecto sobre genes involucrados en la codificación de fimbrias y pelos en E. coli.
El efecto determinado frente a la adhesión fimbrial bacteriana de ECUP de las especies vegetales estudiadas parece ser el primer reporte en este sentido, excepto para la inhibición de la decocción y extractos etanólicos de A. aspera y L. virginicum, evaluadas previamente en un estudio frente a la cepa ATCC 25922 [9].
La actividad antiadherente hallada en doce extractos obtenidos por decocción, sugiere la posibilidad de la relación entre esta forma de preparación tradicional de las plantas para tratar las ITU y la posibilidad de que en este efecto estén involucrados mecanismos en los que se involucren FVs como las fimbrias.
En varias de las especies evaluadas se ha demostrado que poseen una actividad antimicrobiana pobre o nula ante E. coli. Por ejemplo extractos acetónicos de A. clematidea, D. confertiflorus y V. ramonii, no presentaron efecto de inhibición del crecimiento bacteriano en tres cepas de E. coli; mientras que C. bahamensis sí mostró actividad [29]; en otro estudio con estas mismas cepas el efecto del extracto etanólico de P. aduncum fue pobre [30]. Tampoco se refiere actividad frente a esta bacteria en los extractos acuosos de A. aspera y M. oleifera [31] o en el diclorometánico de M. roioc [32].
En el caso de P. aduncum, con gran aval de empleo tradicional en Cuba [33,34] y otros países [35] en diversas enfermedades infecciosas que incluyen afecciones genitourinarias, los estudios muestran resultados divergentes en cuanto a la actividad de sus extractos etanólicos frente a E. coli [36-38].
Sobre D. confertiflorus, al parecer no hay ningún otro estudio de actividad biológica, ni reporte de uso tradicional; mientras que de A. clematidea, solo se ha publicado el empleo de sus raíces tuberosas para tratar las ITU y la litiasis renal en el Municipio Amancio Rodríguez, Las Tunas, Cuba [39].
Si en algunas de las plantas evaluadas, además de una moderada acción bactericida o bacteriostática y de algún efecto diurético, poseyeran actividad sobre FVs bacterianos como la fimbria P, se establecerían de forma sinérgica diferentes mecanismos para evitar el establecimiento bacteriano y combatir infecciones que involucren ECUP [9,10,20,21].
El mecanismo antibacteriano que involucra la fimbria P se ha descrito extensamente en V. macrocarpum. Ahuja et al. [40] describieron el efecto inhibitorio irreversible de esta planta sobre la fimbria P de E. coli JR1 luego de efectuar dos pases sucesivos a la cepa en agar CFA con jugo del fruto al 25%, microfotografías electrónicas demostraron la pérdida total de la fimbria o daño en su estructura. Wojnicz et al. [16], también determinaron mediante el ensayo con eritrocitos humanos, la inhibición de la adhesión de ECUP P+ del extracto acuoso (1mg/ml) de Vaccinium vitis-idaea.
El equipo de Rafsanjany et al. [21] al evaluar el efecto de extractos vegetales en la adhesión de ECUP 2980 a células vesicales humanas T24, constataron que el tratamiento previo a la cepa con los extractos de Agropyron repens (rizoma) y Zea mays (estigma) disminuyeron la adhesión bacteriana; mientras que en las hojas de Betula spp., Orthosiphon stamineus y Urtica spp. se mostró el efecto al interactuar previamente con las células T24. Al enfrentar la bacteria y las células tratadas por separado con los respectivos extractos se evidenció un efecto sinérgico en la actividad evaluada.
Los mecanismos a nivel molecular mediante los que se interfiere la adhesión bacteriana, se ha descrito pudieran estar asociados a una inhibición a nivel plasmídico de la expresión fimbrial. Esto puede ser debido a metabolitos vegetales que actúan como represores de los genes relacionados con las subunidades estructurales de la fimbria P, su transporte o fijación en la superficie celular; así como a la interferencia de los receptores de las células eucariotas [9,21].
El incremento de la sensibilidad de ECUP a los antimicrobianos de los extractos etanólicos de ocho plantas, también resulta promisorio por cuanto sería otra posibilidad en la terapéutica frente a cepas de ECUP antibioresistentes. A la vez que la acción a dosis subletales de fitocompuestos sobre FVs bacterianos, que no provocan una presión de selección elevada, generaría a largo plazo una menor probabilidad de desarrollo de resistencia microbiana [20].
El hecho de que algunas plantas tengan efecto en las dos actividades evaluadas es de importancia, ya que son efectos antimicrobianos que actúan simultáneamente, o de forma sinérgica contra ECUP. Por otro lado, si se verificaran en algunas de estas especies vegetales otros efectos deseados en el tratamiento de las ITUs como bacteriostático, inmunomodulador o diurético, también se aportarían estas actividades en el proceso de superar el cuadro infeccioso. Con todas estas posibilidades se abren nuevas perspectivas para continuar el estudio de la actividad de plantas medicinales sobre FVs de ECUP o sus receptores en las células uroepiteliales.
Una de las limitaciones del presente estudio es el uso exclusivo de una técnica cualitativa para determinar indirectamente la interacción fimbria-receptor, sin evaluar parámetros como la concentración mínima inhibitoria (MIC), que es importante para la aplicación clínica. No obstante, el bioensayo empleado es sencillo, económico y eficaz para realizar un tamizaje inicial de un número considerable de extractos vegetales, lo que permite identificar especies con potencial terapéutico y sentar las bases para estudios más definitivos. Por otra parte, es importante destacar que ciprofloxacino, utilizado en este estudio, ya no se considera dentro del arsenal terapéutico empírico para ITUs en entornos comunitarios y hospitalarios. Para futuras investigaciones, sería relevante comparar los extractos evaluados con otros antibióticos como nitrofurantoína, fosfomicina o ceftriaxona, que tienen mayor aplicabilidad clínica en la actualidad.
Asimismo, se recomienda que la patogenia de Escherichia coli y el efecto de los principios activos se evalúen en modelos experimentales que simulen la formación de biofilms, ya que estos tienen bastante relevancia en la práctica clínica. Finalmente, se propone extender las investigaciones in vitro a otros factores de virulencia, otras cepas de ECUP y otras especies bacterianas, así como realizar estudios in vivo que permitan confirmar y comprender los mecanismos moleculares responsables de la disrupción del efecto de los factores de virulencia. Pese a estas limitaciones, el tamizaje realizado constituye un avance significativo al explorar un conjunto diverso de especies vegetales, brindando una base valiosa para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.
CONCLUSIÓN
Al menos uno de los tres tipos de extractos investigados de 14 de las 16 muestras de 15 especies vegetales evaluadas interfiere in vitro la adhesión de la fimbria P en alguna de las dos cepas de ECUP evaluadas, lo cual es de importancia etnofarmacológica, debido a que indican posibles mecanismos mediante los cuales estas plantas medicinales pueden ejercer su acción ante FVs bacterianos en las ITUs causadas por ECUP. Los extractos de varias de estas especies también pueden incrementar la sensibilidad al cirprofloxacino, lo cual constituye otra actividad de interés para tratamiento de las ITUs. Los resultados obtenidos podrían avalar el empleo tradicional de estas plantas en las ITUs y abren perspectivas de investigación para desarrollar medicamentos herbarios con este fin.
